Аффинная микрофлюидика обеспечивает высокую

Биология связи, том 5, Номер статьи: 1147 (2022) Цитировать эту статью

1291 Доступов

2 Альтметрика

Подробности о метриках

Деградация белка, опосредованная убиквитин-протеасомным путем, регулирует сигнальные события во многих физиологических и патологических состояниях. Анализы деградации in vitro сыграли важную роль в понимании того, как регулируется пролиферация клеток и другие фундаментальные клеточные процессы. Эти анализы являются прямыми, специфичными по времени и высокоинформативными, но также трудоемкими и обычно основаны на низкопроизводительном электрофорезе в полиакриламидном геле с последующей ауторадиографией или иммуноблоттингом. Мы представляем деградацию белков на чипе (pDOC), интегрированную микрофлюидную технологию на основе MITOMI для обнаружения и анализа деградации белков в бесклеточных экстрактах. Платформа включает в себя сотни микрокамер, в которых быстро, одновременно и с использованием небольших количеств реагентов анализируется деградация белков в одной или нескольких физико-химических средах. По сути, pDOC представляет собой чувствительную мультиплексную альтернативу традиционному анализу деградации, имеющую отношение к биомедицинским и трансляционным исследованиям, связанным с регулируемым протеолизом.

Деградация белков системой убиквитин-протеасома является центральным регуляторным модулем, благодаря которому уровень белков во всех эукариотических клетках остается сбалансированным. Отклонение от желаемого количества каждого белка в любой момент может быть вредным для клетки, приводя к дисфункции тканей и широкому спектру заболеваний у человека, включая рак, муковисцидоз и нейродегенеративные расстройства1,2.

Основной каскад, лежащий в основе убиквитинирования, включает три фермента: Фермент Е1 ковалентно связывает и активирует молекулу убиквитина для передачи на фермент, конъюгирующий Е2. Затем конъюгированный с убиквитином E2 взаимодействует с ферментом убиквитин-лигазой E3, который катализирует перенос молекул убиквитина от E2 к целевому белку, обычно через изопептидную связь с остатком лизина. Повторяющиеся события убиквитинирования могут образовывать одну или несколько цепочек убиквитиновых фрагментов на белке-мишени (т.е. полиубиквитинирование). Цепь полиубиквитина, распознаваемая протеасомой, запускает деградацию белка1,2. Сотни различных ферментов E3 управляют огромным функциональным охватом и специфичностью всего процесса убиквитинирования. Что касается клеточной пролиферации и регуляции клеточного цикла, особенно важны комплекс/циклосома, способствующий анафазе убиквитинлигаз (APC/C) и белковый комплекс Skp1-Cullin-F-box (SCF)3,4,5. Субстратная специфичность обоих комплексов зависит от коактиваторов: Cdc20 и Cdh1 для APC/C и одного из нескольких белков F-box для SCF, например Skp2 и β-TrCP6,7,8. В целом, упорядоченный протеолиз, опосредованный ферментами E3, регулируемыми клеточным циклом, обеспечивает однонаправленный клеточный цикл у всех эукариот6,7,8,9,10.

В то время как некоторые формы убиквитиновых цепей маркируют белки для деградации протеасомой, моноубиквитинирование и другие формы полиубиквитинирования регулируют сигнальные каскады посредством независимых от протеасом путей11. Более того, убиквитинирование может быть обращено вспять ферментами, называемыми деубиквитиназами, таким образом, чтобы предотвратить протеолиз12. С другой стороны, протеасомная деградация не всегда может быть связана с убиквитинированием13. Таким образом, деградация белка не может быть выведена из убиквитинирования и должна определяться напрямую.

Анализы деградации белков в бесклеточных экстрактах, также известные как «бесклеточные системы», сыграли важную роль в исследованиях клеточной биологии, позволяя проводить прямой и количественный анализ убиквитин-опосредованного протеолиза в физиологически соответствующих средах. Фактически, большая часть принципов клеточного цикла была открыта путем мониторинга деградации белков клеточного цикла в экстрактах яиц лягушек или циклических клеток человека (см., например, 14,15,16,17,18,19,20). Широкое использование этих «анализов деградации» в современную эпоху является свидетельством их эффективности (см., например, 21,22,23). Интересно, что традиционные анализы деградации никогда по-настоящему не использовали современные технологии и по-прежнему полагаются на гель-электрофорез, авторадиографию или иммуноблоттинг и большое количество биологического материала.